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Mayer begann als Sohn eines Apothekers nach dem Abitur in Tübingen ein Medizinstudium, das er 1838 abschloss. Nach einem Aufenthalt in Paris (1839/40) diente er 1840/41 als Schiffsarzt auf einem holländischen Ostindienfahrer und besuchte Java.
1841 ließ er sich in Heilbronn nieder, wurde zum Oberamtswundarzt gewählt und heiratete im Jahr darauf. Unmittelbar nach seiner Rückkehr nach Deutschland schickte er an Johann Christian Poggendorffs Annalen der Physik; eine Abhandlung, in der er einen Erhaltungssatz der Kraft (gemeint war Energie) postulierte. Da sie fundamentale physikalische Irrtümer enthielt, wurde sie nicht publiziert. Unbeirrt verfolgte Mayer die Idee weiter und setzte sich mit dem Tübinger Physikprofessor Nörremberg auseinander, der seine Hypothese zwar ablehnte, ihm aber eine wertvolle Anregung gab, wie er sie experimentell überprüfen könnte.
Wenn Bewegungsenergie sich in Wärmeenergie verwandelt, müsste Wasser durch Schütteln zu erwärmen sein. Mayer konnte nicht nur diesen Nachweis führen, sondern bestimmte auch den quantitativen Faktor der Umwandlung, das Wärmeäquivalent. Das Ergebnis seiner Untersuchungen veröffentlichte er 1842 im Maiheft von Justus von Liebigs Annalen der Chemie und Pharmacie. In seinem Büchlein Die organische Bewegung im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel (1845) konnte er den Zahlenwert des Wärmeäquivalents noch präzisieren.
Doch die zeitgenössischen Physiker lehnten seinen Energieerhaltungssatz ab. Man bezweifelte Mayers Qualifikation in physikalischen Fragen und verleumdete ihn. 1850 erlitt er einen psychischen Zusammenbruch, musste sich zur Behandlung in eine Nervenheilanstalt begeben und wurde schließlich als geheilt entlassen. Es dauerte noch ein Jahrzehnt, bis seiner Entdeckung die gebührende Aufmerksamkeit entgegengebracht wurde und man ihn mit Ehrungen überhäufte.