Depuis la découverte du phénomène au début du XXe siècle, de nombreuses applications ont vu le jour dans des domaines variés des sciences et techniques. Ainsi la microscopie optique va permettre de déceler la présence de divers composés par l'observation de la fluorescence.

La microscopie en fluorescence fait désormais partie des méthodes de recherche utilisée en routine.

Historique de la microscopie de fluorescence

Aux environ de l’an 1000 existait chez l’empereur de Chine, un tableau magique sur lequel un bœuf apparaissait chaque soir. Ce fut le premier exemple, dans l’histoire, d’un matériau fabriqué par l’Homme, capable d‘émettre de la lumière luminescente. Ce procédé fut retrouvé involontairement par un cordonnier à la fin du XVIe siècle. La luminescence est un procédé qui peut se scinder en 2 grandes catégories : la fluorescence et la phosphorescence.

Un objet éclairé émet de la lumière dans toutes les directions de l’espace à une longueur d’onde différente de la longueur d’onde excitatrice. Pour une substance donnée si l‘émission de la lumière cesse dés l’arrêt de l’excitation alors on la dit fluorescente, si cette émission continue alors la substance est phosphorescente.

En fluorescence on distingue deux types d’objets : les premiers émettent de la lumière fluorescente par eux-mêmes, on parle de fluorescence primaire ou autofluorescence( chlorophylle, huile…), les autres doivent être combinés à une substance fluorescente pour émettre de la fluorescence on parle donc de fluorescence secondaire. En microscopie de fluorescence on combine des substances, des cellules, des molécules non fluorescentes avec des fluorochromes pour les visualiser (le DAPI marque l’ADN qui fluoresce en bleu).

Le microscope est un outil d’observation qui a vu le jour au XIXe siècle. Le microscope optique traditionnel, le microscope électronique à balayage, le microscope électronique à transmission, le microscope optique de fluorescence, le confocal sont maintenant utilisés en routine dans de nombreux laboratoires. Le microscope de fluorescence est construit de façon à produire un rayonnement de fluorescence et l’observer. En microscopie de fluorescence, on utilise l’informatique pour traiter les images (déconvolution).

Dans ce domaine (microscopie de fluorescence) de nombreuses techniques se sont développées.

· Le marquage simple se fait par affinité entre un fluorochrome et la molécule à marquer.

· L’immunomarquage direct ou indirect font intervenir un anticorps marqué.

· La technique du FISH sert à marquer des séquences nucléotidiques.

· La GFP consiste à intégrer dans le génome de la cellule à observer un gène de protéine fluorescente, la protéine synthétisée est alors fluorescente.

· Le FRET utilise deux fluorochromes, un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur. Elle permet d’étudier des interactions entre deux molécules.

La microscopie de fluorescence a de nombreux domaines d’application.