高知城下の町人郷士・坂本直足の次男として生まれる。名は直陰、後に直柔。竜馬は通称。他に才谷梅太郎などの変名がある。姉は坂本乙女（おとめ）。

江戸に出て千葉周一の弟に剣を学ぶ。土佐に戻った後、文久元年（1861年）に武市瑞山らの土佐勤王党結成に参画するが、翌年の勤王党による吉田東洋の暗殺には参加せず、その直前に脱藩した。諸国を放浪した後、江戸に出て勝海舟の門に入り、神戸海軍操練所の設立に努力する。

文久三年（1863年）の八月十八日の政変で幕政が反動化すると、勝海舟の紹介で西郷隆盛を頼って薩摩藩に保護される。その援助により、慶応三年（1865年）、土佐脱藩の仲間と共に長崎で「亀山社中」を組織し、物産・武器の貿易を行った。

慶応二年（1866年）、坂本竜馬の斡旋により、京都で長州の木戸孝允と薩摩の西郷隆盛が会見し、薩長同盟が結ばれた。同年、第二次長州征伐で長州藩海軍を指揮。慶応三年（1867年）、土佐藩との関係を修復して、「海援隊」を創設した。後藤象二郎とともに船中八策を策定し、山内豊信を説いて土佐藩の大政奉還を実現させた。

京都の旅寓・近江屋で中岡慎太郎と共に暗殺された。暗殺は新選組によるものと信じられていたが、大正時代になって見廻組隊士だった今井信郎が名乗り出た。